UNIVERSIDAD AUTNOMA METROPOLITANA XOCHIMILCO

OBTENCIN DE CIDO FERLICO POR HIDRLISIS DEL MAZ

-2013

OBTENCIN DE CIDO FERLICO POR HIDRLISIS DE MAZ Alan Huerta Acosta*, Yolanda Rodrguez Jorge*, Ivonne Quetzali Valencia Lpez*, Omar Villegas Villegas* *Estudiantes de Qumica Farmacutica Biolgica. Ciencias Biolgicas y de la Salud, Universidad autnoma Metropolitana Xochimilco, Mxico D.F.

RESUMEN El cido ferlico, tambin llamado cido 3-(4-hidroxi-3- metoxifenil)-2-propenoico, es un derivado del cido cinmico, extremadamente abundante en la naturaleza y en el pericarp io del maz (1g/kg), se encuentra en forma libre o enlazado por medio de enlaces ster a algunos residuos de a-L-arabinosa, sacrido que se encuentra en la hemicelulosa de la pared celular vegetal. Para poder liberarlo es necesario hidrolizarlo qumica o enzimticamente, el mecanismo de hidrlisis no ha sido del todo estudiado, pero se cree que sucede del mismo modo que una hidrolisis de steres. Las feruloil esterasas, son enzimas que ocasionan la liberacin del cido ferlico a travs de la hidrlisis del enlace ster; adems son producidas por un gran nmero de microorganismos presentes en el nejayote. El maz (Zea mays) contiene ms fenoles totales y mayor poder antioxidante que cereales como trigo, arroz y avena. El principal cido hidroxicinmico es el cido ferlico, que representa alrededor de 85 % de los fenoles totales presentes en el maz. El objetivo principal de este trabajo fue identificar la presencia de cido ferlico en el nejayote. El mtodo que se utilizo para su extraccin fue por hidrlisis cida, y para su identificacin se utilizo la tcnica de cromatografa en capa fina. Se obtuvo como producto total 0.828g de acido ferlico y un R.f. de: 0.25. Se considera que el mtodo de acidificacin es ms eficaz que otros. Se obtuvo el compuesto esperado con una mezcla de otros componentes que fueron observados mediante luz ultravioleta (UV). El Nejayote es un medio inestable para extraer de forma directa el cido ferlico, sin embargo al acidificarlo se permite al contenido microbiano por medio de las enzimas feruoil esterasas llevar a cabo la hidrlisis para obtener el cido ferlico.

PALABRAS CLAVE: cido ferlico, hidrlisis, nejayote, maz, enzimas feruoil esterasas.

ABSTRACT Ferulic acid, also called 3 - (4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-2-propenoic acid is a derivative of cinnamic extremely abundant in nature and corn pericarp (1g/kg), is in free or bound through ester linkages to some -L-arabinose residues, saccharide hemicellulose is in the plant cell wall. Release is necessary to chemically or enzymatically hydrolyzing the hydrolysis mechanism has not been fully studied, but is believed to occur in the same way that an ester hydrolysis. The feruloyl esterases are enzymes which cause the release of ferulic acid through hydrolysis of the ester bond, are also produced by a number of microorganisms present in the nejayote. Maize (Zea mays) contains more phenols and more antioxidant power than cereals like wheat, rice and oats. The main phenol is ferulic acid, which accounts for about 85% of total phenols. The main objective of this work was to identify the presence of ferulic acid in nejayote. The method used for extraction was by acid hydrolysis, and identification technique was used for thin layer chromatography. Total product was obtained as ferulic acid and 0.828g of an R.f. 0.25. It is considered that the acidification method is more effective than others. Expected compound is obtained with a mixture of other components which were observed by ultraviolet light (UV). The half nejayote is unstable to directly extract the ferulic acid to acidify it nevertheless allows the microbial content through feruloyl esterase enzymes carry out hydrolysis for ferulic acid. KEYWORDS: ferulic acid, hydrolysis, nejayote, corn, feruoyl esterase enzymes.

INTRODUCCIN En Mxico la Nixtamalizacin es un proceso en el que el grano de maz es sometido a un tratamiento alcalino (cal, hidrxido de calcio o leja). Es un proceso requerido para la elaboracin de mltiples alimentos a base de maz, como las tortillas, los tamales, los totopos, entre otros. Debido a esto, en nuestro pas se generan diariamente cantidades importantes del lquido residual de la nixtamalizacin llamado nejayote, el cual ha sido utilizado para la generacin de compuestos como el cido ferlico, compuesto precursor en la produccin de vainilla, importante en la industria farmacutica por sus efectos teraputicos y como protector solar [1,2,3]. El objetivo del presente proyecto es la obtencin de cido ferlico a partir de nejayote por hidrlisis cida. El nejayote contiene diversos cidos cinmicos, entre ellos el acido ferlico [4]; est compuesto principalmente de agua, cal viva (CaMgO 2 ) y residuos de cascarilla y endospermo de maz, tambin contiene una gran variedad de [1, 5, 6] microorganismos . El pericarpio de maz es la fuente ms prometedora de cido ferlico pues posee altas concentraciones de este componente. Los residuos de la industria de la tortilla generalmente son desechados y utilizados para preparar alimento para ganado. As, la utilizacin del nejayote como fuente potencial de cido ferlico representa una alternativa para disminuir el costo de extraccin de cido ferlico [1, 7, 4 ,6] . El nejayote contiene diversos microorganismos que son capaces de

catalizar la hidrlisis para obtener el cido ferlico, la presencia de estos microorganismos es gracias a su pH el cual es aproximadamente de 9. En el nejayote existen microorganismos alcalfilos identificados como Bacillus megaterium , productores de enzimas con capacidad de catalizar reacciones a determinado pH [8, 9]. Existen varios mtodos para extraer cido ferlico, el mtodo por hidrlisis alcalina o por hidrlisis cida del nejayote son de los menos costosos y fciles de realizar en laboratorio. La hidrlisis alcalina no es muy eficaz ya que se obtienen rendimientos verdaderamente bajos o impuros. Uno de los mtodos ms importantes y mejores para la extraccin de acido ferlico es la hidrlisis enzimtica, solo que existe un inconveniente: El mtodo enzimtico no es un mtodo prctico para producir cido ferlico comercial debido al alto costo de la produccin de enzimas a partir de microorganismos [10]. Para identificacin de cidos cinmicos en el nejayote existen diversas tcnicas, sin embargo La tcnica ms usual, menos costosa y ms prctica es la cromatografa en capa fina [11] . Por todo lo anterior en este trabajo se ha optado por la extraccin de acido ferlico a partir de nejayote por medio de hidrlisis cida. Y para identificar la presencia de dicho cido se ha utilizado la cromatografa en capa fina.

ANTECEDENTES En 1866 Hlasiwetz y Barth en Innsbrucx, Austria, aislaron cido protocatecuico y resorcinol de la resina comercial de una planta conocida como frula foetida, al mismo tiempo obtuvieron un precipitado ligeramente amarillo despus de la adicin de plomo divalente a una solucin alcohlica de la resina, luego de que la sal de plomo fue lavada con alcohol y reconstituido el cido libre, se determin su composicin como C 10 H10 O4 lo nombraron cido ferlico. Poca investigacin al respecto se realiz sobre este recin descubierto cido durante los siguientes 60 aos; en 1925 fue sintetizado qumicamente por la condensacin de vainillina con cido malnico catalizada con amina. Los ismeros cis y trans fueron separados en 1957 y la estereoqumica del cido ferlico fue revelada por RMN13 C y confirmada por cristalografa en rayos X en 1988 [12]. Origen biosinttico del cido ferlico Las plantas sintetizan una gran variedad de productos secundarios que contienen un anillo aromtico con uno o ms grupos hidroxilos, incluyendo sus derivados funcionales. Estas sustancias reciben el nombre de compuestos fenlicos o polifenoles. Desde el punto de vista de la estructura qumica, los fenoles son un grupo muy diverso que comprende desde molculas sencillas como los cidos fenlicos hasta polmeros complejos como los taninos y la lignina. En el grupo tambin se encuentran flavonoides y los

cidos hidroxicinmicos (Compuestos C6 C3 ). Los compuestos fenlicos estn directamente relacionados con las caractersticas de los alimentos, tales como sabor, polaridad, efectos farmacolgicos, etc. Los cidos hidroxicinmicos son un grupo de compuestos fenlicos encontrados ampliamente en plantas y semillas, conocidos principalmente por su funcin antioxidante. Los principales cidos hidroxicinmicos son: cido cafico, cido cumrico y cido ferlico. Este ltimo es el ms abundante de los cidos hidroxicinmicos [7, 8, 10]. Su origen biosinttico se encuentra en los aminocidos fenilalanina y tirosina. Bajo la influencia de enzimas, que para el primero de ellos se llama fenilalanina amnico liaza (PAL), dicho aminocido experimenta una transformacin funcional muy poco frecuente que no tiene equivalente en procesos in vitro: la eliminacin de amoniaco en la fenilalanina forma un doble enlace c=c, dando lugar al cido cinmico, Posteriormente al hidroxilar el cido cinmico se forma el cido p-cumrico el cual es el precursor del cido ferlico. Curiosamente, la mayora de las plantas no son capaces de llevar a cabo una transformacin semejante en el aminocido tirosina. Una notable excepcin son la gramneas, que pueden hacerlo gracias a disponer de una enzima denominada tirosina amoniaco liaza (TAL), equivalente a su efecto al enzima PAL antes mencionado. El cido cinmico y p-cumrico son ejemplos arquetpicos de compuestos fenilpropanoides, es decir, del tipo

estructural C 6 C3 . Sirven asimismo de precursores biosintticos de otros compuestos C 6 C3 . Mediante reacciones de oxidacin, reduccin, alquilacin, etc. Estos cidos no aparecen en la naturaleza nicamente de forma libre, sino tambin esterificando grupos hidroxilos de otras estructuras, muy a menudo de tipo carbohidrato [13]. Propiedades fsicas del cido ferlico Su nombre sistemtico es: 3-(4-hidroxi-3metoxifenil)-2-propenoico (Imagen a). Generalmente existe como el ismero trans; las agujas ortorrmbicas de este ismero pueden ser cristalizadas de agua caliente. Su masa molecular es de 194 g/mol. Y su punto de fusin es de 174C. Es soluble en etanol, acetato de etilo y agua caliente; moderadamente soluble en ter y ligeramente soluble en benceno y ter de petrleo. Es un fuerte cido diprtico; la disociacin del primer protn produce el anin carboxilato, la de un segundo protn genera el anin fenolato. El ismero trans absorbe fuertemente en el ultravioleta a una longitud de onda de 248 nm y 307 nm en solucin acuosa pH=6; tambin exhibe una fuerte fluorescencia. Fuentes Se encuentra presente en maz, arroz, trigo, avena, sorgo, forraje, caf tostado, tomate, esprragos, olivos, moras, chicharos, frutos ctricos y hojas, en las semillas generalmente se halla en la fraccin de la fibra. En sus fuentes naturales es difcil encontrarlo en forma

libre, generalmente se encuentra como ster, covalentemente enlazado con monosacridos, disacridos, polisacridos, glicoprotenas, lignina, betacianinas y otros carbohidratos y biopolmeros insolubles de la pared celular vegetal [8, 9, 14].

Capacidad antioxidante La capacidad antioxidante del cido ferlico deriva en su mayora de su habilidad de estabilizar a los radicales libres, tambin disminuye los efectos de la radiacin ultravioleta, por ello es el principal componente de varios bloqueadores solares. Cualquier radical que se encuentre cercano al cido ferlico, fcilmente atrae a un tomo de hidrgeno para formar un radical fenoxilo, el cual est altamente estabilizado por resonancia, dado que el electrn libre puede deslocalizarse en toda la molcula. Una estabilizacin extra proviene de la conjugacin en la cadena lateral insaturada [16]. Composicin Qumica del Maz El pericarpio se caracteriza por un contenido elevado de fibra cruda, aproximadamente el 87%, la que a su vez est formada fundamentalmente por hemicelulosa (67%), celulosa (23%), lignina (0.15%) [1, 2, 3].

Mecanismos de Hidrlisis El cido ferlico se encuentra ligado al pericarpio del maz por enlaces ster, para poder liberarlo es necesario hidrolizarlo qumicamente o enzimticamente. Las feruoil esterasas, son enzimas que ocasionan la liberacin del cido ferlico a travs de la hidrlisis del enlace ster; adems son producidas por un gran nmero de microorganismos que se hayan presentes en el nejayote. Las feruoil esterasas pertenecen a las cinamoil cido esterasas que son enzimas del tipo carboxil ster hidrolasas. Estas enzimas hidrolizan los enlaces ster formados entre los cidos hidroxicinmicos y los azcares primarios (a-L-arabinosa o P-Dgalactosa) de la red de polisacridos de la pared celular vegetal (Imagen 1). La actividad cido ferlico esterasa (FAE) fue detectada en los sobrenadantes de los cultivos de Streptomyces olivochromogenes y Schizophylum commune. Aos despus aparece el primer trabajo que detalla la purificacin y caracterizacin de una feruoil esterasa (4-hidroxi-3- metoxicinmico cido esterasa), a partir del sobrenadante de los cultivos de Streptomyces [15] olivochromogenes . Para llevar a cabo la hidrlisis la mayora de las veces estas enzimas necesitan interactuar con otras enzimas ya que solamente un nmero limitado de feruoil esterasas son capaces de hidrolizar directamente el cido ferlico a partir de la fraccin insoluble de la hemicelulosa estas enzimas se activan en un pH cido o bsico, es por ello que la hidrlisis acida es eficiente.

En el caso de la pared celular de las semillas monocotiledneas del maz, se encuentra en mayor proporcin la hemicelulosa, la cual consiste principalmente de arabinoxilano o xilano, cuya estructura reside en un esqueleto formado por unidades de xilosa (150-200) arregladas en forma lineal, con presencia de ramificaciones que consisten de unidades de otros azcares como la manosa, arabinosa, galactosa, glucosa, arabinosa y cidos glucornicos. El esqueleto de xilosa se encuentra a su vez sustituido con re siduos de -L-arabinosil en las posiciones 0-2 y 0-3 de las unidades de xilosa. Adems, algunos de los residuos de -L-arabinosa se encuentran sustituidos en las posiciones C-5 con molculas de cido ferlico, mediante enlace ster [8, 9]. (Imagen 2)

El mecanismo de hidrlisis an no ha sido del todo estudiado, sin embargo, se cree que ocurre por hidrlisis similar a la de un ster en medio cido, gracias a la accin de las feruoil esterasas que son activadas al llevar a medio cido a los microorganismos presentes en el nejayote [8, 9, 5, 6] .

1. Lo primero que ocurre es que el grupo carbonilo aumenta su reactividad al protonarse.

El cido ferlico se encuentra en concentraciones elevadas en la pared celular de diferentes plantas monocotiledneas, principalmente en el maz. El oligosacrido O-{5 -O-[(E)feruoil]- -L-arabinofuranosil)-(1-3)-O- D-xilopiranosil-(1,4)-D-xilopiranosa (FAXX), es un ejemplo de oligosacrido feruloilatado presente en el maz (imagen 3).

(1)

2. Como en el medio de reaccin existe

4. Una vez que se ha formado un

agua, una molcula es adicionada al carbono del enlace C=O.

excelente grupo saliente por parte del azcar, la resonancia hace que salga expulsado, generando otro intermediario cido. Este intermediario que se forma es muy estable por la presencia de otro grupo hidroxilo que permite deslocalizar an ms la carga.

(2)

Existe un equilibrio cido-base intramolecular, entre el azcar y el ion hidronio generado a partir de la adicin de agua al carbonilo.
3.

(4) 5. Por ltimo el intermediario que se

gener anteriormente sufre otro equilibrio cido-base con el agua que se encuentra en el medio, generando un ambiente cido en el sistema. Y liberando el cido ferlico

(3) (5)

OBJETIVOS Aislar el cido ferlico por medio de la hidrolisis cida del nejayote. Identificar por cromatografa en capa fina el cido ferlico obtenido. MATERIALES Y MTODOS Para La extraccin e identificacin de acido ferlico se ocuparon los siguientes materiales y reactivos.
Material 1 Vaso de precipitados de 1L 3 Matraces Erlenmeyer de 500ml 1 Embudo Buchner 1 Matraz Kitazato 1 Esptula Reactivos Nejayote

PROCEDIMIENTO Procedimiento para obtener el nejayote Se colocaron 3 litros de agua por 1Kg de maz, agregndole 5g de (cal viva) CaMgO 2 (a veces la cantidad de cal vara dependiendo del tipo del maz, para calcular la cantidad de cal a usar el maz debe de cambiar a color amarillo intenso). Se calent el agua (Imagen b) hasta que la cascarilla del pericarpio logro desprenderse al tacto (frotarlo con las yemas de los dedos). Se dejo enfriar durante 24 horas, enseguida se filtra el agua residual, obteniendo aproximadamente 2 litros de Nejayote.

HCl

Acetato de etilo Hexano cido actico glacial cido ferlico como estndar 5mg Liquido revelador. Sulfato de sodio anhidro Placas cromatogrfi cas y cmara Magneto

1 Probeta de 250ml

1 Probeta de 25ml 4 Pipetas de 10 y 5ml Lmpara UV

Rotavapor

Procedimiento para Extraccin de cido Ferlico 1.- Se coloc un litro de nejayote en un Matraz Erlenmeyer, ste se coloc sobre una parrilla elctrica en agitacin constante. 2.- Al vaso de precipitado se le agreg cido clorhdrico por goteo, hasta alcanzar un pH de 6 y se mantuvo en agitacin por media hora (Imagen 4).

4.- Terminado el paso anterior, el contenido del vaso de precipitado se dividi en 2 porciones de 500 mL. 5.- Se colocaron las porciones en un embudo de separacin con 100 mL de acetato de etilo, se agit el embudo de separacin y se dej en reposo para obtener una fase orgnica y una acuosa. Enseguida se decant, y se agit la fase acuosa por 20 minutos, este paso se repite 2 veces (Imagen 6).

3.- Por consiguiente se filtr al vaco para retirar partculas suspendidas de la muestra (imagen 5).

6.- Se reuni el acetato de etilo obtenido de la extraccin (fase orgnica), se filtr, se sec con sulfato de sodio anhidro y se volvi a filtrar (Imagen 7). La fase acuosa se neutralizo y se desecho.

Preparacin de la cmara cromatogrfica La preparacin de la cmara para eluir la muestra del estndar de cido ferlico y el producto obtenido, consisti en una solucin de proporcin 7:3 de hexano y acetato de etilo ms 2 gotas de cido actico glacial; total 10ml. Como reveladores se usaron la Luz Ultravioleta y un revelador de FeCl3 en MeOH (imagen 9).

7.- la fase orgnica Se destil con evaporador rotatorio. El residuo contuvo cido ferlico y para comprobar su pureza se realiz cromatografa en capa fina, comparndolo con un estndar de cido ferlico (Imagen 8). RESULTADOS. Para llevar a cabo la acidificacin del Nejayote el cual se encontraba inicialmente en pH 10 se agregaron 132gotas de HCl; equivalente a 2.5ml de HCl El residuo que se obtuvo del evaporador rotatorio se identific por medio de cromatografa en capa fina como cido

ferlico, comparado con una muestra estndar comercial de cido ferlico. El peso inicial del envase con el filtrado de cido ferlico fue de 151.173g. El peso final del envase con el extracto evaporado fue de 152.001g. Se obtuvo como producto total 0.828g R.f. cromatografa en capa fina: 0.25

DISCUSIN Las paredes celulares vegetales contienen ms cantidad de cido ferlico, debido a que ste se encuentra enlazado con los polisacridos, por ello resulta difcil liberarlo y purificarlo. A pesar de la abundancia del cido ferlico en las paredes celulares el valor terico de obtencin de ste es de 1g/kg [11] . Lo que est muy cercano con el resultado que se obtuvo de 0.828 g, que se extrajo. Finalizado el proceso se realiz cromatografa en capa fina, para identificar el compuesto orgnico que haba en el producto resultante, ya que esta tcnica es la nica que hace posible la separacin de los componentes hacindolos visibles al revelarlo a la luz UV. Se compar el producto obtenido con el estndar de cido ferlico, para comprobar que ste fuera el esperado. En este procedimiento se prepar una cmara de desarrollo con los disolventes que eran capaces de eluir los compuestos del producto que se tena, separando tres platos tericos debido a las diferentes polaridades de los eluyentes. Obtenidas las cromatoplacas se observ que el estndar y la muestra eran

semejantes, aunque el compuesto que se obtuvo en el laboratorio no era totalmente puro; ya que en el procedimiento no se utiliz carbn activado para purificarlo; sin embargo se considera que el R.f. observado que fue de 0.25, est dentro del parmetro aceptado para extractos vegetales que es de 0.2 a 0.8 [11]. Se realiz 2 veces este procedimiento de cromatografa, tanto del producto que se obtuvo como el estndar del cido ferlico, para tener un resultado ms confiable (Imagen 10).

CONCLUSIN A partir del mtodo usado para la extraccin de cido ferlico por acidificacin del Nejayote, se obtuvo el compuesto esperado con una mezcla de otros componentes que fueron observados mediante la luz ultravioleta, esto significa que el producto contena trazas de otros

aceites esenciales caractersticos del maz; al compararlo con el estndar comercial se observ un resultado semejante, que es significativo para la identificacin del compuesto. El mtodo de hidrlisis cida logra reducir significativamente los costos del procedimiento y el tiempo de operacin para realizar una extraccin del cido ferlico puro. El Nejayote es un medio inestable para extraer de forma directa el cido ferlico por su pH alcalino de 9, al acidificarlo con HCl y llevarlo a pH 6, se permite al contenido microbiano por medio de las enzimas feruoil esterasas llevar a cabo la hidrolisis del enlace ster que une al acido ferlico a los residuos de a-L-arabinosa. En cambio la alcalinidad y contenido microbiano del nejayote crean un ambiente de inestabilidad que ocasiona variaciones importantes en la concentracin del cido ferlico. Por esta razn se obtuvieron estos resultados mencionados en la discusin. En base a todo lo anterior, podemos decir que la extraccin del cido ferlico por medio de la hidrlisis cida del nejayote, se obtuvo satisfactoriamente debido a que coincidieron los resultados de cromatografa con la muestra comercial de acido ferlico.

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