Instituto de Ciencias (ICUAP)

A todo el personal del Instituto de Biomedicina de Valencia. A los investigadores, becarios y personal del laboratorio, muchas gracias a todos por la convivencia en estos años, por vuestra ayuda siempre que la he necesitado. Al personal de mantenimiento, administración, informática, seguridad, limpieza …, por solucionar los pequeños desastres y por facilitarnos el dia a dia. Al Profesor Ignacio Fita, por su inestimable ayuda y apoyo, por hacer que la cristalografía sea más fácil. Al Dr. Alberto Marina, por su disponibilidad en todo momento. Al Dr. Javier Cervera y a su grupo, por permitirme colaborar con vosotros. A las Dras. Nuria Verdaguer y Cristina Vega por su dedicación y paciencia en la coordinación del BAG. A los miembros del laboratorio CRI2 del Instituto de Biologia Molecular de Barcelona por echarme un cable siempre que lo he necesitado y por su buena acogida durante mis visitas. A todos los investigadores que he conocido durante estos años, por participar en mi formación científica y en las inquietudes de los que estamos aprendiendo. A mis padres, mi hermana y mi marido, muchas gracias por vuestro interés, por vuestro apoyo incondicional, por compartir conmigo el entusiasmo y la euforia y por no dejarme flojear en momentos de desesperación. Gracias por motivame a estudiar y a trabajar en lo que realmente me apasiona y por apoyarme en las decisiones más importantes de mi vida. Muchas gracias. vi vii ÍNDICE Introducción general ………………………………………………… 1 Objetivos ……………………………………………………………… 23 Capítulo 1 …………………………………………………………… Site-directed mutagenesis of Escherichia coli acetylglutamate kinase and aspartokinase III probes the catalytic and substrate-binding mechanisms of these amino acid kinase family enzymes and allows three-dimensional modelling of aspartokinase. Capítulo 2 …………………………………………………………… First-time crystallization and preliminary X-ray crystallographic analysis of a bacterial-archaeal type U MP kinase, a key enzyme in microbial pyrimidine biosynthesis. Capítulo 3 …………………………………………………………… The crystal structure of Pyrococcus furiosus UMP kinase provides insight into catalysis and regulation in microbial pyrimidine nucleotide biosynthesis. Capítulo 4 …………………………………………………………… A novel two-domain architecture within the amino acid kinase enzyme family revealed by the crystal structure of Escherichia coli glutamate 5-kinase. Resumen de los resultados ………………………………………… 139 Discusión General ………………………………………………… 151 Conclusiones ……………………………………………………… 171 Bibliografía ……………………………………………………… 175 Correspondiente a la introducción general, resumen de resultados y discusión general. viii E.C. 2.7.2. Fosfotransferasas con un grupo carboxilo como aceptor

Las enfermedades zoonóticas emergentes (EZE) se han convertido en la actualidad en una de las amenazas más graves para la salud pública del orbe. Aproximadamente el 75 % de las enfermedades que han surgido en los últimos 25 años tienen su fuente en la fauna silvestre. México es un país magabiodiverso que alberga alrededor del 10 % de esta riqueza biológica. Las recientes epidemias (SARS), infecciones por virus West Nilo o influenza aviar, demuestran la importancia de las EZE en el país. El propósito de este trabajo es dar información general sobre las EZE y valorar, el impacto de estas, en la salud pública y de los animales (biodiversidad); así como su importancia social bajo el concepto de (Una Salud). Para vigilar estas EZE, es preciso disponer de un equipo de trabajo multidisciplinario, con el fin de establecer un marco teórico y metodológico que responda a las problemáticas actuales y que culmine en la búsqueda y generación de programas de vigilancia epidemiológica, protocolos y medidas para la prevención de estas enfermedades de reciente aparición (Virus sin nombre, Hantavirus, H1N1, Lyme, Leishmaniosis) en México.

Las Enfermedades Emergentes (ED) son enfermedades nuevas. La brucelosis es la
zoonosis infecciosa emergente (DZE) más importante en el orbe. Actualmente se
reconocen 11 spp. y se están describiendo otras 4 más. En el país se han
diagnosticado en los últimos 5 años a 2 x 104 personas, por lo que es considerada una
zoonosis de primer orden en México (Morales et al., 2012). En Puebla, esta enfermedad
se detectó hace 95 años, y a la fecha no se ha logrado controlar ni erradicar de la
Región de los Llanos, al extremo Oriente del Eje Neovolcánico Transversal (ENT)
considerándose como una enfermedad ―endémica‖ en términos médicos(Castro et al.,
2005). Afección que en la Región infecta a un promedio de 300 personas y 1800 cabras
al año (CESAPUE, 2014). Por otra parte, Castañeda et al., (2005), reportó a B.
melitensis en agua estancada y de lluvia en San Nicolás Buenos Aires, Puebla y Ramos
(2009) aisló a B. melitensis en agua marina de las costas de Nayarit. Así como

Brucellosis is an important zoonosis that can infect man, cattle and wildlife.
There are currently 12 species of Brucella with various hosts, such as whales, armadillos,
baboons, frogs, etc. In the present study, it has been made positive isolation of Brucella
bacteria in the genus Poblana (fish), Ambystoma (amphibians), Sceloporus (lizards) and
Peromyscus (wild mice), were carried out in an area endemic for human brucellosis
incidences of up to 30%) and of goats (with incidence up to 50%) located in the
municipality of Guadalupe Victoria, Puebla, Mexico. The Plate-agar isolations were
obtained from soft tissue samples (liver, kidney and yolk sac) in adult females of the four
taxonomic groups and identified by routine testing. The bp26 gene, which is specific for the
Brucella genus with 1029bp, was amplified by PCR and compared with reference vaccine
strains (BM16 and BS19). The profiles of the isolates were found to be identical at the
genus level with Brucella vaccine strains. This is the first report of isolation for this
zoonotic bacterium in endemic Mexican fauna. These results support the hypothesis of
vertical transmission of brucellosis in endemic areas of the disease, as well as the varied
adaptation, etiology and pathogenesis of Brucella towards other emergent hosts. These data
could be a useful tool to improve understanding of the virulence of Brucella genus in the
natural environmen

Las enfermedades zoonóticas emergentes (EZE), se
han convertido en la actualidad en una de las más
graves amenazas para la salud pública.
Aproximadamente el 75% de las enfermedades
surgidas en los últimos 25 años, tienen su fuente en
la fauna silvestre. Las recientes epidemias en la
declinación de poblaciones de anfibios y reptiles,
demuestran su importancia también. Brucella con
sus 11 spp. es la EZE más importante del orbe. En el
estado de Puebla se considera una enfermedad
endémica, derivada del ganado caprino, con alta
incidencia y morbilidad en la Cuenca Oriental, área
donde se encuentran algunos lagos cráter. Esta
zona, es considerada por CONABIO como Región
Prioritaria. En este trabajo se reportan los primeros
aislamientos del género Brucella en anfibios y
reptiles de la Región de los lagos cráter. Se efectuó
el primoaislamiento de Brucella derivado de tejidos
de órganos por separado, en Placa-Agar con cristal
violeta, se realizó la purificación de ADN de las
muestras y PCR buscando la amplificación del gene
bp26 que es específico del género (1029 pb). Estos
resultados confirman la hipótesis, de la transmisión
vertical y horizontal de esta zoonosis en zonas
endémicas, así como la variada adaptación, etiología
y patogenia de Brucella spp. hacia otros nichos
(hospederos) o vectores, y el potencial impacto
ecológico, producido por la bacteria, en el medio
ambiente y su posible efecto deletéreo en la
biodiversidad local como reservorios. Estos datos

Las enfermedades zoonóticas emergentes (EZE), son una amenaza para la salud pública. El 75% de las
enfermedades surgidas en los últimos 25 años, tienen su fuente en la fauna silvestre. Las recientes epidemias
por Hafnia, Streptococcus y Vibrio, demuestran su importancia también. Brucella con sus 11 spp. es la EZE más
importante del orbe. afectando a diversos animales acuáticos, por ejemplo: La trucha arcoíris (Oncorhynchus
mykiss), El bagre del Nilo (Clarias gariepinus). En el estado de Puebla, se considera a la brucelosis una
enfermedad endémica, derivada del ganado caprino, con alta incidencia y morbilidad en la Cuenca Oriental,
área donde se encuentran algunos lagos cráter. Esta zona, es considerada por CONABIO como Región
Prioritaria. En este trabajo se reportan los primeros aislamientos de Brucella spp. en peces del género Poblana.
Se efectuó el primoaislamiento de Brucella derivado de tejidos de órganos por separado, en Placa-Agar con
cristal violeta, se realizó la purificación de ADN de las muestras y PCR buscando la amplificación del gen bp26
que es específico del género (1029 pb). Estos resultados confirman la hipótesis, de la transmisión vertical y
horizontal de esta zoonosis en zonas endémicas, así como la variada adaptación, etiología y patogenia de
Brucella spp. hacia otros nichos (hospederos) o vectores, y el potencial impacto ecológico, producido por la
bacteria, en el medio ambiente acuatico y su posible efecto deletéreo en la biodiversidad local como la ictiofauna
nativa. Estos datos podrían ser una herramienta útil para la mejor comprensión de la patogénesis, vínculos
filogenéticos y virulencia de la brucelosis en el medio natural, en zonas endémicas de la enfermedad. Algunas
especies de Brucella se mantienen activas en poblaciones de la fauna silvestre, como reservorios, tanto en
especies terrestres como acuáticas. Haciendo relevante el papel de los ictiólogos como profesionistas
multidisciplinarios, en la medicina de la conservación.

RESUMEN. El concepto de salud y enfermedad es multicausal, e incluye al huésped, al agente microbiológico y al medio ambiente. En México, existe un incremento notable de las enfermedades zoonóticas emergentes (EZE) que pueden afectar a la biodiversidad local. Brucella con 12 spp., se ha declarado como (EZE) en 56 países. En el oriente del estado de Puebla, se ha reportado a la brucelosis como endémica en comunidades rurales y ganado caprino. En los lagos cráter La Preciosa y Atexcac; existe aún fauna nativa importante: Limnocytherina axalapasco (Ostrácodo), Poblana letholepis (Charal) Ambystoma velasci (Ajolote), Lithobates chichicuahuatla (Rana), Sceloporus megalepidurus (Lagartija), Peromyscus bullatus (Ratón), Xerospermophilus perotensis (Ardilla) entre otros. De las que poco se conoce de su biología y actualmente no existe información de (EZE) o de acciones concretas para su conservación. Asimismo en la ribera de estos Axalapascos se encuentran dos comunidades rurales en las que su población presenta una alta incidencia y una prevalencia del 30% por brucelosis crónica de origen animal, por el consumo de quesos frescos. Por lo que el objetivo de este estudio fue determinar la presencia de Brucella spp. en representantes de la fauna nativa de los lagos, mediante técnicas de Diagnóstico (Indirectas, RB, SAT) de Aislamiento,(Medio selectivo Agar BRUCELLABUAP ®), diagnóstico (Tinción de Gram, Pruebas Bioquímicas CIT, URE, TSI, MIO y H 2 S) y molecular (PCR-TR), durante un ciclo anual, con miras a su conservación. En los resultados se detectó mediante las pruebas descritas y se aisló a Brucella spp. en todos los grupos estudiados, con una confirmación del 60% en promedio de los grupos, después del aislamiento de DNA bacteriano de Brucella spp. y purificación se obtuvo una amplificación por PCR-TR de 1029 pb, del gen bp26,con una p ≤ 0.05 en el 10% del total de los organismos estudiados. Se concluye que en la zona de estudio existe una zoonosis muy importante por Brucella spp., misma que ha traspasado al ecosistema silvestre (peces, anfibios, lagartijas y mamíferos pequeños) poniendo en potencial riesgo la biodiversidad y generando un problema socioambiental emergente en los pobladores de las comunidades rurales circunvecinas.

El concepto de salud y enfermedad es multicausal, e incluye al huésped, al agente microbiológico y al medio ambiente. En México, existe un incremento notable de las enfermedades zoonóticas emergentes (EZE) que pueden afectar a la biodiversidad local. Brucella con 12 spp., se ha declarado como (EZE) en 56 países. En el oriente del estado de Puebla, se ha reportado a la brucelosis como endémica en comunidades rurales y ganado caprino. En los lagos cráter La Preciosa y Atexcac; existe aún fauna nativa importante: Limnocytherina axalapasco (Ostrácodo), Poblana letholepis (Charal) Ambystoma velasci (Ajolote), Lithobates chichicuahuatla (Rana),  Sceloporus megalepidurus (Lagartija), Peromyscus bullatus (Ratón), Xerospermophilus perotensis (Ardilla) entre otros. De las que poco se conoce de su biología y actualmente no existe información de (EZE) o de acciones concretas para su conservación. Asimismo en la ribera de estos Axalapascos se encuentran dos comunidades rurales en las que su población presenta una alta incidencia y una prevalencia del 30% por brucelosis crónica de origen animal, por el consumo de quesos frescos. Por lo que el objetivo de este estudio fue determinar la presencia de Brucella spp. en representantes de la fauna nativa de los lagos, mediante técnicas de Diagnóstico (Indirectas, RB, SAT) de Aislamiento,(Medio selectivo Agar BRUCELLABUAP®), diagnóstico (Tinción de Gram, Pruebas Bioquímicas CIT, URE, TSI, MIO y H2S) y molecular (PCR-TR), durante un ciclo anual, con miras a su conservación. En los resultados se detectó mediante las pruebas descritas y se aisló a Brucella spp. en todos los grupos estudiados, con una confirmación del 60% en promedio de los grupos, después del aislamiento de DNA bacteriano de Brucella spp. y purificación se obtuvo una amplificación por PCR-TR de 1029 pb, del gen bp26,con una p ≤ 0.05 en el 10% del total de los organismos estudiados. Se concluye que en la zona de estudio existe una zoonosis muy importante por Brucella spp